引物合成在分子生物學(xué)研究中起著重要的作用，它的基本原理是基于固相合成技術(shù)，通過逐個(gè)添加堿基來構(gòu)建所需的引物序列，并通過純化和驗(yàn)證確保引物的質(zhì)量和純度。
目前引物合成基本采用固相亞磷酰胺三酯法，是將DNA固定在固相載體上完成DNA鏈的合成的，合成的方向是由待合成引物的3′端向5′端合成的，相鄰的核苷酸通過3′→5′磷酸二酯鍵連接。亞磷酰胺三酯法合成DNA片段，具有高效、快速的偶聯(lián)以及起始反應(yīng)物比較穩(wěn)定的特點(diǎn)。
| 純化方式 | 純化原理 | 優(yōu)點(diǎn) | 缺點(diǎn) | 適用范圍 |
|---|---|---|---|---|
| DSL純化 | 采用最新的biolytic氣象氨解儀，在高純氨氣水蒸汽混合物的氣相氨解環(huán)境下將連接在CPG上的引物切割洗脫下來,能有效地去除鹽分,經(jīng)過有機(jī)溶劑的梯度洗脫能去除部分的雜質(zhì)。 | 相比傳統(tǒng)的液相氨解高效，快速，無交叉污染，所有純化方法中最簡(jiǎn)單的一種。 | 不能有效去除比目的片段短的小片段，前提是合成效果很好時(shí)才能選用此法。 | PCR擴(kuò)增、亞克隆、點(diǎn)突變、全基因合成及DNA測(cè)序等。 |
| OPC純化 | 利用OPC柱中裝有對(duì)DMT基團(tuán)具有特殊親和力的樹脂，合成DNA片段時(shí)保留5’端最后一個(gè)堿基上的DMT，所有合成產(chǎn)物吸附在OPC柱上以后，用稀的有機(jī)溶劑洗柱，帶有DMT片段的吸附能力強(qiáng)，不易被洗脫，不帶有DMT的片段吸附能力弱從而被洗脫，然后用酸脫去吸附在OPC柱上DNA的DMT，再用濃一點(diǎn)的有機(jī)溶劑洗脫DNA。 | 方便、快捷 | 其專一性吸附DMT能力有限，不免仍然有短片段帶入的可能，而且負(fù)載量小，特別是對(duì)長(zhǎng)于40個(gè)堿基以上的 片段純化效果不好。 | PCR,引物的關(guān)鍵在于5′序列 如限制性酶切位點(diǎn)；指定位點(diǎn)突變；合成文庫時(shí)的第一條鏈cDNA合成；克隆接頭的產(chǎn)生。 |
| PAGE純化 | 利用不同長(zhǎng)度序列DNA在凝膠中遷移率不同來分離目標(biāo)序列和失敗序列，從而提供高純度的目標(biāo)引物。 對(duì)長(zhǎng)鏈引物(大于40 mer)的純化特別有效。本公司采用和C18反相柱連用，毛細(xì)管電泳，純度大于85%。 | 純化效果好，尤其是純化長(zhǎng)鏈效果好。 | 自動(dòng)化程度低，純化過程中引物損耗較大，發(fā)貨周期相對(duì)較長(zhǎng)。 | 40 mer以上的普通引物的純化最有效方式；用于定點(diǎn)突變、克隆；蛋白結(jié)合凝膠遷移電泳分析、治療與診斷用途。 |
| HPLC純化 | HPLC根據(jù)吸附介質(zhì)分為反相柱和離子柱。反相柱是根據(jù)疏水性的差別來分離的，即疏水性更強(qiáng)的長(zhǎng)片段比短片段吸附能力更強(qiáng)，后出峰；離子柱上根據(jù)不同長(zhǎng)度寡核苷酸帶有不同凈電荷，較長(zhǎng)的片段帶有高電荷比帶有電荷低的短片段在離子柱內(nèi)流動(dòng)得慢，從而依次將不同片段洗脫出來。 | 自動(dòng)化程度高，省人力，純化效果好，純度可達(dá) 99%以上，特別是在標(biāo)記引物和特殊修飾探針純化中效 果好。 | 純化量小，不能純化長(zhǎng)片段，設(shè)備昂貴。 | ＜50 mer的普通引物的純化，用于定點(diǎn)突變、克隆、蛋白結(jié)合凝膠遷移電泳分析、治療用途；修飾引物的純化；商業(yè)化的診斷引物或探針。 |
| 磷酸化 Phosphoryl | 5’磷酸化可用于接頭、克隆和基因構(gòu)建以及連接酶催化的連接反應(yīng)。 磷酸化可抗外切酶消化的相關(guān)實(shí)驗(yàn)中，也用于阻止DNA聚合酶催化的DNA鏈延伸反應(yīng)。 |
| 生物素 Biotin | 生物素修飾能夠耐受熱和pH。生物素化的DNA能夠成功的轉(zhuǎn)化進(jìn)入細(xì)菌 。 引物生物素標(biāo)記，可用于非放射性免疫分析來檢測(cè)蛋白質(zhì)、胞內(nèi)化學(xué)染色、細(xì)胞分離、核酸分離、雜交檢測(cè)特異性的DNA/RNA序列、離子通道構(gòu)象變化等。 |
| 地高新 Digoxigenin | 地高新是一種從毛地黃植物分離出來的類固醇物質(zhì)，因?yàn)槊攸S植物的花和葉子是這種物質(zhì)唯一自然來源， 所以抗地高新抗體不會(huì)結(jié)合到其他生物物質(zhì)。地高新經(jīng)由一個(gè)11個(gè)原子的間臂連接到脲嘧啶的C5位置。雜交的地高新探針可以由抗地高新抗體來檢測(cè)， 這個(gè)抗體一般會(huì)與堿性磷酸酶，過氧化物酶，熒光素或膠體金偶連。或者沒有偶連的抗地高新抗體但偶連的抗抗體。 地高新標(biāo)記的探針可用于各種雜交反應(yīng)，如DNA-DNA雜交（Southern blotting），DNA-RNA雜交（Northern blotting）斑點(diǎn)雜交（Dot blotting ）， 克隆雜交，原位雜交以及酶聯(lián)免疫分析（ELISA）。 |
| 內(nèi)部氨基修飾 | 主要用C6-dT aminolinker來加到胸腺嘧啶殘基上來進(jìn)行內(nèi)部修飾。修飾后氨基與主鏈相距10個(gè)原子距離，可用于進(jìn)一步的標(biāo)記和酶連接（如堿性磷酸酶）。 |
| 5'氨基修飾 | 可用于制備功能化的寡核苷酸，廣泛應(yīng)用在DNA芯片（DNA Microarray）和多重標(biāo)記診斷系統(tǒng)。目前提供5' C6 氨基修飾和5' C12氨基修飾兩種， 前者可用于連接一些即便靠近寡核苷酸也不會(huì)影響其功能的化合物，后者用于親和純化基團(tuán)的連接和一些熒光標(biāo)記，尤其是當(dāng)熒光可能會(huì)因標(biāo)記太靠近DNA鏈而被淬滅時(shí)。 |
| 3'氨基修飾 | 可用于制備功能化的寡核苷酸，廣泛應(yīng)用在DNA芯片（DNA Microarray）和多重標(biāo)記診斷系統(tǒng)。目前提供5' C6 氨基修飾和5' C12氨基修飾兩種， 前者可用于連接一些即便靠近寡核苷酸也不會(huì)影響其功能的化合物，后者用于親和純化基團(tuán)的連接和一些熒光標(biāo)記，尤其是當(dāng)熒光可能會(huì)因標(biāo)記太靠近DNA鏈而被淬滅時(shí)。 |
| Spacer | 5'-巰基在很多方面與氨基修飾類似。巰基可用于加附各種修飾如熒光標(biāo)記物和生物素。 例如可以在碘乙酸和馬來酰亞胺衍生物存在下來制作巰基連接的熒光探針。 5'的巰基修飾主要用5'巰基修飾單體（5'-Thiol-Modifier C6-CE Phosphoramidite 或Thiol-Modifier C6 S-S CE Phosphoramidite）。 用5'-Thiol-Modifier C6-CE單體修飾后必須進(jìn)行硝酸銀氧化以去除保護(hù)基（trityl），而Thiol-Modifier C6 S-S CE單體修飾后須用DTT將二硫鍵還原成巰基。 |
| 硫代 Phosphorothioate | 硫代修飾的寡核苷酸主要用于反義實(shí)驗(yàn)中防止被核酸酶降解。 您可以選擇全硫代，但隨著硫代堿基的增加，寡核苷酸的Tm值會(huì)降低，為了降低這種這種影響， 可以對(duì)引物兩端2-5個(gè)堿基進(jìn)行硫代修飾，通常可以選擇5'和3'各3個(gè)堿基進(jìn)行硫代修飾。 |
| 脫氧脲嘧啶 DeoxyUridine，dU | 脫氧脲嘧啶可以插進(jìn)寡核苷酸來增加雙鏈的熔點(diǎn)溫度從而增長(zhǎng)雙鏈的穩(wěn)定性。 每個(gè)脫氧胸腺嘧啶被脫氧脲嘧啶替代可以增長(zhǎng)雙鏈熔點(diǎn)溫度1.7 ℃。 |
| 脫氧次黃嘌呤 deoxyInosine，dI | 脫氧次黃嘌呤是一個(gè)自然存在的堿基， 雖然不是真正意義上的通用堿基但當(dāng)與其它堿基結(jié)合時(shí)會(huì)比其它堿基錯(cuò)配相對(duì)更穩(wěn)定。 脫氧次黃嘌呤與其它堿基的結(jié)合能力為dI:dC > dI:dA > dI:dG > dI:dT. 在DNA聚合酶的催化下，脫氧次黃嘌呤首選與dC結(jié)合。 |
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