引物合成在分子生物學研究中起著重要的作用，它的基本原理是基于固相合成技術，通過逐個添加堿基來構建所需的引物序列，并通過純化和驗證確保引物的質量和純度。
目前引物合成基本采用固相亞磷酰胺三酯法，是將DNA固定在固相載體上完成DNA鏈的合成的，合成的方向是由待合成引物的3′端向5′端合成的，相鄰的核苷酸通過3′→5′磷酸二酯鍵連接。亞磷酰胺三酯法合成DNA片段，具有高效、快速的偶聯以及起始反應物比較穩定的特點。
| 純化方式 | 純化原理 | 優點 | 缺點 | 適用范圍 |
|---|---|---|---|---|
| DSL純化 | 采用最新的biolytic氣象氨解儀，在高純氨氣水蒸汽混合物的氣相氨解環境下將連接在CPG上的引物切割洗脫下來,能有效地去除鹽分,經過有機溶劑的梯度洗脫能去除部分的雜質。 | 相比傳統的液相氨解高效，快速，無交叉污染，所有純化方法中最簡單的一種。 | 不能有效去除比目的片段短的小片段，前提是合成效果很好時才能選用此法。 | PCR擴增、亞克隆、點突變、全基因合成及DNA測序等。 |
| OPC純化 | 利用OPC柱中裝有對DMT基團具有特殊親和力的樹脂，合成DNA片段時保留5’端最后一個堿基上的DMT，所有合成產物吸附在OPC柱上以后，用稀的有機溶劑洗柱，帶有DMT片段的吸附能力強，不易被洗脫，不帶有DMT的片段吸附能力弱從而被洗脫，然后用酸脫去吸附在OPC柱上DNA的DMT，再用濃一點的有機溶劑洗脫DNA。 | 方便、快捷 | 其專一性吸附DMT能力有限，不免仍然有短片段帶入的可能，而且負載量小，特別是對長于40個堿基以上的 片段純化效果不好。 | PCR,引物的關鍵在于5′序列 如限制性酶切位點；指定位點突變；合成文庫時的第一條鏈cDNA合成；克隆接頭的產生。 |
| PAGE純化 | 利用不同長度序列DNA在凝膠中遷移率不同來分離目標序列和失敗序列，從而提供高純度的目標引物。 對長鏈引物(大于40 mer)的純化特別有效。本公司采用和C18反相柱連用，毛細管電泳，純度大于85%。 | 純化效果好，尤其是純化長鏈效果好。 | 自動化程度低，純化過程中引物損耗較大，發貨周期相對較長。 | 40 mer以上的普通引物的純化最有效方式；用于定點突變、克隆；蛋白結合凝膠遷移電泳分析、治療與診斷用途。 |
| HPLC純化 | HPLC根據吸附介質分為反相柱和離子柱。反相柱是根據疏水性的差別來分離的，即疏水性更強的長片段比短片段吸附能力更強，后出峰；離子柱上根據不同長度寡核苷酸帶有不同凈電荷，較長的片段帶有高電荷比帶有電荷低的短片段在離子柱內流動得慢，從而依次將不同片段洗脫出來。 | 自動化程度高，省人力，純化效果好，純度可達 99%以上，特別是在標記引物和特殊修飾探針純化中效 果好。 | 純化量小，不能純化長片段，設備昂貴。 | ＜50 mer的普通引物的純化，用于定點突變、克隆、蛋白結合凝膠遷移電泳分析、治療用途；修飾引物的純化；商業化的診斷引物或探針。 |
| 磷酸化 Phosphoryl | 5’磷酸化可用于接頭、克隆和基因構建以及連接酶催化的連接反應。 磷酸化可抗外切酶消化的相關實驗中，也用于阻止DNA聚合酶催化的DNA鏈延伸反應。 |
| 生物素 Biotin | 生物素修飾能夠耐受熱和pH。生物素化的DNA能夠成功的轉化進入細菌 。 引物生物素標記，可用于非放射性免疫分析來檢測蛋白質、胞內化學染色、細胞分離、核酸分離、雜交檢測特異性的DNA/RNA序列、離子通道構象變化等。 |
| 地高新 Digoxigenin | 地高新是一種從毛地黃植物分離出來的類固醇物質，因為毛地黃植物的花和葉子是這種物質唯一自然來源， 所以抗地高新抗體不會結合到其他生物物質。地高新經由一個11個原子的間臂連接到脲嘧啶的C5位置。雜交的地高新探針可以由抗地高新抗體來檢測， 這個抗體一般會與堿性磷酸酶，過氧化物酶，熒光素或膠體金偶連。或者沒有偶連的抗地高新抗體但偶連的抗抗體。 地高新標記的探針可用于各種雜交反應，如DNA-DNA雜交（Southern blotting），DNA-RNA雜交（Northern blotting）斑點雜交（Dot blotting ）， 克隆雜交，原位雜交以及酶聯免疫分析（ELISA）。 |
| 內部氨基修飾 | 主要用C6-dT aminolinker來加到胸腺嘧啶殘基上來進行內部修飾。修飾后氨基與主鏈相距10個原子距離，可用于進一步的標記和酶連接（如堿性磷酸酶）。 |
| 5'氨基修飾 | 可用于制備功能化的寡核苷酸，廣泛應用在DNA芯片（DNA Microarray）和多重標記診斷系統。目前提供5' C6 氨基修飾和5' C12氨基修飾兩種， 前者可用于連接一些即便靠近寡核苷酸也不會影響其功能的化合物，后者用于親和純化基團的連接和一些熒光標記，尤其是當熒光可能會因標記太靠近DNA鏈而被淬滅時。 |
| 3'氨基修飾 | 可用于制備功能化的寡核苷酸，廣泛應用在DNA芯片（DNA Microarray）和多重標記診斷系統。目前提供5' C6 氨基修飾和5' C12氨基修飾兩種， 前者可用于連接一些即便靠近寡核苷酸也不會影響其功能的化合物，后者用于親和純化基團的連接和一些熒光標記，尤其是當熒光可能會因標記太靠近DNA鏈而被淬滅時。 |
| Spacer | 5'-巰基在很多方面與氨基修飾類似。巰基可用于加附各種修飾如熒光標記物和生物素。 例如可以在碘乙酸和馬來酰亞胺衍生物存在下來制作巰基連接的熒光探針。 5'的巰基修飾主要用5'巰基修飾單體（5'-Thiol-Modifier C6-CE Phosphoramidite 或Thiol-Modifier C6 S-S CE Phosphoramidite）。 用5'-Thiol-Modifier C6-CE單體修飾后必須進行硝酸銀氧化以去除保護基（trityl），而Thiol-Modifier C6 S-S CE單體修飾后須用DTT將二硫鍵還原成巰基。 |
| 硫代 Phosphorothioate | 硫代修飾的寡核苷酸主要用于反義實驗中防止被核酸酶降解。 您可以選擇全硫代，但隨著硫代堿基的增加，寡核苷酸的Tm值會降低，為了降低這種這種影響， 可以對引物兩端2-5個堿基進行硫代修飾，通常可以選擇5'和3'各3個堿基進行硫代修飾。 |
| 脫氧脲嘧啶 DeoxyUridine，dU | 脫氧脲嘧啶可以插進寡核苷酸來增加雙鏈的熔點溫度從而增長雙鏈的穩定性。 每個脫氧胸腺嘧啶被脫氧脲嘧啶替代可以增長雙鏈熔點溫度1.7 ℃。 |
| 脫氧次黃嘌呤 deoxyInosine，dI | 脫氧次黃嘌呤是一個自然存在的堿基， 雖然不是真正意義上的通用堿基但當與其它堿基結合時會比其它堿基錯配相對更穩定。 脫氧次黃嘌呤與其它堿基的結合能力為dI:dC > dI:dA > dI:dG > dI:dT. 在DNA聚合酶的催化下，脫氧次黃嘌呤首選與dC結合。 |
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